Šiuolaikiškose laboratorijose, susijusiose su gyvybės mokslais – ir nebūtinai fundamentaliai mokslinėse, bet ir medicinos ar net kriminalistikos – darbo veikiausiai nebeįmanoma įsivaizduoti be polimerazės grandininės reakcijos (PGR) – proceso, leidžiančio sukurti daugybę tiriamos dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) grandinės fragmento kopijų.
„Šiuolaikinėje medicinoje, molekulinėje diagnostikoje, PGR taikoma patogenų identifikavimui, virusų kvantifikavimui, paveldimų ligų diagnostikai, tėvystės nustatymui, vėžinių ląstelių diagnostikai, mutacijų nustatymams, kriminalistų tyrimams, genotipų nustatymams (vienas iš šio tyrimo pritaikymo būdų – tinkamiausio vaisto ir jo dozės parinkimas), imuninio atsako nustatymui, DNR pažeidimo nustatymui ir kitiems tikslams“, - sakė bendrovėje „ThermoFisher Scientific“ dirbanti mokslininkė dr. Giedrė Šinkūnaitė-Maršalkienė, vadovaujanti PGR rinkinių kūrimo grupei.
DNR – mūsų visų sandarą ir funkcijas lemiantys cheminiai elementai, savotiški instrukcijų, kaip organizmas turi atrodyti ir funkcionuoti, rinkiniai. Kiekvienas žmogus (ir apskritai – kiekvienas lytiškai besidauginantis gyvis) yra unikalus, nes pusę savo genetinių instrukcijų jis paveldi iš mamos, o pusę iš tėčio.
Nors genetinių instrukcijų rinkiniai yra didžiuliai ir sudėtingi, nors jie saugomi praktiškai bet kokioje gyvoje ląstelėje, mokslininkų instrumentai nėra tokie fantastiškai jautrūs, kad iš lašo kraujo ar iš vieno plauko svogūnėlio stebuklingu būdu nustatytų, kokia to mėginio genetinė sandara. Tam reikia genetinę medžiagą padauginti, kartais net milijonais kartų – tuomet DNR fragmentų sankaupas galima net plika akimi pamatyti.
PGR – su kuo tai valgoma?
Tam tikra prasme PGR galima vadinti mikroskopu, per kurį galime žvelgti į DNR struktūrą.
„PGR - tai procedūra, kurios metu padauginamas pageidaujamas konkretus DNR fragmentas. Dauginamo DNR fragmento ilgis priklauso nuo papildomai į reakciją pridėtų trumpų sekų (pradmenų), iš kurių vienas atitinka dauginamos sekos pradžią, o kitas DNR sekos pabaigą. Po pirmo ciklo gaunamos 2 ieškomo DNR fragmento kopijos (nes DNR yra dvigrandė), po antro ciklo 4 kopijos ir t.t..(principas – (2n)). Po kiekvieno ciklo tiriamosios DNR sekos tirpale padaugėja dvigubai iki tol, kol išsibaigia reagentai. Jei kiekvieno ciklo metu dauginama DNR seka dvigubėja tolygiai, tai, pavyzdžiui, po 20 ciklų gauname 1 048 576 DNR kopijų“, - metodo veikimo principą glaustai nupasakojo dr. Giedrė Šinkūnaitė-Maršalkienė.
Tipiniai PGR elementai yra polimerazė (šiam procesui naudojamas karščiui atsparus fermentas, pasiskolintas iš karštųjų versmių bakterijos Thermus aquaticus), DNR pradmenys ir daugybė nukleotidų bazių (citozino, guanino, adenino ir tirozino). Šie elementai sumaišomi su tiriamąja medžiaga ir pakaitinami iki 95 °C (štai dėl ko reikia, kad fermentas būtų atsparus karščiui) – tuomet tiriamosios medžiagos DNR grandinė „išsitiesina“, dviguba grandinė atsiskiria į dvi atskiras juostas, prie kurių reakcijos mišiniui vėstant prikimba pradmenys. Tuomet temperatūra vėl pakeliama iki tokios, kuri yra palankiausia polimerazei „dirbti“, ir šioji, atradusi visus dvigubus DNR fragmentus (t. y., tiriamosios genetinės medžiagos fragmentą, prie kurios prikibęs ją atitinkantis pradmuo), panaudodama tirpale esančias medžiagas sukuria dvi pradinės DNR grandinės kopijas.
Jeigu įsivaizduotume, kad bandoma nustatyti tėvystę, vaiko mamos ir tėvo DNR analizuojamos fragmentų juostelės turėtų sutapti: vaikas pusę savo genetinės medžiagos paveldi iš tėvo, pusę – iš mamos. Jeigu nustatinėjamas infekcijos sukėlėjas, padauginus biologinę medžiagą, kurioje turėtų būti ir sukėlėjo DNR pėdsakų, ji lyginama su numanomo sukėlėjo „etalonu“.
Geniali mintis gimė važiuojant ilsėtis
Geniali mintis, kaip padauginti pageidaujamus DNR fragmentus, Karry Mullisui į galvą šovė tam nelabai tinkamoje vietoje – bevairuojant savo „Honda Civic“ iš Kalifornijos valstijos miesto Berkelio į atokvėpio trobelę Mendocine. Tai įvyko 1983 metais, vieną gegužės penktadienio vakarą. Begalvojant apie darbo su genais sunkumus, apie pavienių nukleotidų polimorfizmų nustatymo problemas, mokslininkui į galvą šovė mintis, nusakanti genetinio fragmento padauginimą tūkstančius ir milijonus kartų, tiek pat kartų sustiprinanti ir genetinio fragmento aiškaus nustatymo galimybę.
Kaip pats mokslininkas rašo savo svetainėje, mintis buvo tokia stulbinanti, kad K. Mullisas turėjo nusukti į šalikelę apraminti įsiaudrinusį protą. Nuvykęs iki namelio mokslininkas kiaurą naktį negalėjo užmigti. Net ir kitą naktį, po idėjos gvildenimo bendraujant su buteliu vyno, K. Mullisas miegojo neramiai.
1995 metais, po užtrukusio metodo vystymo ir tobulinimo, JAV patentų biurui buvo pateikta jį aprašanti patento paraiška, kuri patvirtinta 1987 metais. Mokslininkas iš įmonės „Cetus“, kurios vardu registruotas patentas, gavo 10 000 JAV dolerių premiją.
O po dešimtmečio, 1993 metais, K. Mullisas, išsišiepęs nuo ausies iki ausies, taurę vyno kėlė jau Stokholme, kartu su Švedijos karališkąja šeima ir džiaugėsi ką tik gautu Nobelio apdovanojimu už polimerazės grandininės reakcijos atradimą.
Beje, metodo vertė bėgant laikui tiek išaugo, kad 1991 metais, kuomet „Cetus“ susiliejo su kita biotechnologijų bendrove „Chiron“, PGR patentas buvo parduotas garsiai vaistų gamybos korporacijai „Hoffman-La Roche“. Jo vertė buvo stulbinantys 300 mln. JAV dolerių.
Nestovi vietoje
Mokslas niekada nestovi vietoje – net ir, atrodytų, tobulus dalykus galima dar labiau patobulinti, labiau specializuoti, padidinti tikslumą ar kitus rūpimus parametrus. Klasikinis PGR metodas iki šių dienų taip pat buvo ištobulintas tiek, kad atsirado daugiau nei dešimtis jo variacijų: kiekybinė PGR, karšto starto PGR, skaitmeninė kiekybinė PGR ir keletas kitų.
Įdomu tai, kad esama netgi PGR ir meno sąsajų – viena iš PGR variacijų, besisukančio rato amplifikacija (angl. Rolling cycle amplification) yra paremta rato apskritumo savybe. dr. G. Šinkūnaitė-Maršalkienė teigia, jog Salvadoro Dali ir Mauritso Corneliso Eschero paveiksluose esama RCA metodo iliustracijų.
Kaip gi taip? Juk M.C. Escheras mirė 1972 metais, kai nebuvo nė minties apie PGR, o S. Dali dailininko karjerą baigė 1984 metais, kai apie PGR metodą buvo žinoma tik jį tobulinantiems mokslininkams ir praktikoje jis dar nebuvo taikomas. O ką kalbėti apie tik gerokai vėliau sukurtą RCA modifikaciją...
Iš tiesų dailininkai tikrai nepiešė galvodami apie DNR fragmentų dauginimą – tai mokslininkai jų paveiksluose, sukurtuose vaikantis visai kitų idėjų, įžvelgė vaizdus, kurie iliustruoja jų naudojamų metodų veikimo principus.
Pavyzdžiui, M. C. Eschero 1960 metais sukurtoje iliuzijoje „Ascending & Descending“ „pavaizduota uždara laiptinė, kurioje žmonės lipa aukštyn ir žemyn be sustojimo. Tai taip ir besisukančio rato amplifikacijos metode žmonės atitinka polimerazę, kuri nuskaito DNR grandinę, ją vis skaito ratu, vis skaito ir skaito, nesustojamai. Sustoja tik kai išsibaigia reagentai“, - paveikslo prasmę aiškino mokslininkė.
Tuo tarpu Salvadoro dali darbas „Sprogstanti rafaeliška galva“, pasak dr. G. Šinkūnaitės-Maršalkienės, „vaizduoja sferinį objektą, primenantį moters galvą, kuris sudarytas iš nesuskaičiuojamų mažų panašaus ilgio ir struktūros fragmentų, kurie besisuka aplink centrinį tašką. Analogiškai yra ir RCA metode, kai polimerazė nuo žiedinės DNR padaugina DNR sekas. Šie padauginti DNR fragmentai atsišakoja nuo žiedinės DNR ir vaizdas analogiškas kaip šiame paveiksle“.
Milžinų pečiai
Įdomu tai, jog šis K. Mulliso darbas, įvertintas Nobelio premija, istoriškai nuvilnija iki pačių pirmųjų Nobelio premijų ir puikiai iliustruoja šiuolaikinio mokslo esmę, trumpai apibūdinamą kaip „stovėjimas ant milžinų pečių“. Mat genetiniai tyrimai būtų neįsivaizduojami be DNR dvigubos grandinės struktūros išaiškinimo (už šį darbą Nobelio premiją 1962 pasidalino trys mokslininkai - Francis Harry Comptonas Crickas, Jamesas Dewey Watsonas ir Maurice'as Hugh Frederickas Wilkinsas). PGR rezultatų analizė būtų neįmanoma be 1948 m. chemijos Nobelio premijos laureato Arne Wilhelmo Kaurino Tiseliuso, sugalvojusio ir tobulinusio elektroforezės metodus.
O DNR struktūros atradėjai vargu ar būtų galėję ką nustatyti be rentgeno kristalografijos metodo, už kurį Nobelio premija 1915 metais skirta tėvui ir sūnui – Serui Williamui Henry Braggui ir Williamui Lawrence'ui Braggui. Šie rentgeno kristalografijos metodą sukūrė remdamiesi Maxo von Laue darbu (už kurį fizikas Nobelio premijos nusipelnė ankstesniais, 1914 metais). M. von Laue nustatė, jog rentgeno spinduliams kertant kristalus, vyksta spindulių difrakcija.
Bet, žinoma, visa tai nebūtų įmanoma be Wilhelmo Conrado Röntgeno – mokslininko, kuris ne tik gavo pačią pirmą Nobelio fizikos premiją 1901 metais, bet ir visiems laikams įsirašė į mokslo istoriją jo vardu pavadinus itin skvarbius, žmogaus akimi nematomus spindulius (tiesa, daugelyje kalbų tos garbės W. C. Röntgenui teikiama mažiau – spinduliai paties mokslininko iniciatyva dėl savo paslaptingumo iki šiol vadinami X-rays ar kitais atitikmenimis su raide X).
Ir pats K. Mullisas tapo milžinu, ant kurio pečių stovi netgi ne šiaip pavieniai mokslininkai, o visi su genų tyrimais bent kažką bendro turintys specialistai (Nobelio premijomis apdovanojami mokslininkai, medikai, kriminalistai – sąrašą galima tęsti) ir galinga specializuotų PGR rinkinių gamybos pramonė, kurios vieni iš pasaulinių lyderių - „ThermoFisher Scientific“ - PGR rinkinius kuria gamina Lietuvoje.
