CRISPR-manija: nuo gerųjų jogurto bakterijų iki genomo redagavimo įrankių

 (8)
Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto mokslininkų komanda (prof. Virginijus Šikšnys, dr. Giedrius Gasiūnas ir Tautvydas Karvelis) – viena pirmųjų mokslininkų grupių, atradusių, kad Cas9 baltymas gali būti panaudotas tiksliam DNR redagavimui, siekiant specifinių genomo pokyčių. Šios technologijos taikymas medicinoje padės gydant paveldimas ligas, o žemės ūkyje – kuriant naujas augalų veisles, atsparias sausrai ar ligoms.
Prof. V. Šikšnys
Prof. V. Šikšnys
© VU nuotr.

Rytas, greiti pusryčiai... Atsidarote šaldytuvą, paimate jogurto su gyvosiomis bakterijomis indelį ir sėdate pusryčiauti. Tikriausiai nesusimąstote, kad valgydami jogurtą kartu suvalgote ir milijonus Streptococcus thermophilus bakterijų (1 pav.). Ne todėl, kad jos labai skanios, tiesiog jos buvo naudojamos jogurtui surauginti.

Jogurto ir sūrio gamyba šiandien yra milijardų dolerių verta pramonė, kuriai grėsmę kelia akimi nematomi priešai – bakteriofagai, arba bakterijų virusai. Jie puola bakterijas ir stengiasi patekti į jų vidų, kad galėtų ten pasidauginti. Patekę į vidų, virusai užvaldo bakterijas ir panaudoja jų resursus naujų viruso dalelių gamybai, o nebereikalingas bakterijas dažnai nužudo. Jei virusai užpuola bakterijas, kurios naudojamos jogurto ar sūrio gamyboje, gresia didžiuliai nuostoliai.

1 pav. Jogurto gamyboje naudojamos Streptococcus thermophilus DGCC7710 bakterijos sudaro sulankstytą grandinę (gr. streptococcus) primenančias kolonijas. Šiose bakterijose yra keturios skirtingos CRISPR-CAS sistemos, kurios padeda bakterijoms apsisaugoti
1 pav. Jogurto gamyboje naudojamos Streptococcus thermophilus DGCC7710 bakterijos sudaro sulankstytą grandinę (gr. streptococcus) primenančias kolonijas. Šiose bakterijose yra keturios skirtingos CRISPR-CAS sistemos, kurios padeda bakterijoms apsisaugoti nuo virusų
© VU nuotr.

Kadangi bakterijai susidūrus su virusu kyla hamletiškas „būti ar nebūti“ klausimas, bakterijos ilgainiui, vykstant evoliucijai, įgijo apsaugos sistemas, padedančias kovoti su virusais. Kai kuriose bakterijose tos sistemos sudaro apie trečdalį bakterijos DNR ir jų palaikymas brangiai kainuoja. Bet tai yra lyg ir tam tikras bakterijų „draudimo polisas“, kuris atsiperka, kai jas užpuola virusai. 2007 m. mokslininkų grupė, dirbanti „Danisco“ kompanijoje, kuri gamino Streptococcus thermophilus bakterijų kultūras, naudojamas jogurtui rauginti, atrado ir „Science“ žurnale aprašė naują bakterijų antivirusinės apsaugos sistemą, kurią pavadino CRISPR. Kuo ši sistema įdomi ir kuo ji skiriasi nuo kitų?

Mokslininkai parodė, kad ši sistema veikia kaip primityvi bakterijų imuninė sistema, kuri apsaugo Streptococcus thermophilus bakterijas, kad nepatektų virusų genetinė medžiaga. Paaiškėjo, kad kai kurios bakterijos, susidūrusios su savo mirtinais priešais – virusais, sugeba išgyventi. Jos iškerpa mažus viruso DNR fragmentus ir įterpia juos į savo genomo CRISPR regioną, taip įrašydamos į savo „genominę atmintį“ viruso užpuoliko profilį (2 pav.).

2 pav. CRISPR sistemų veikloje galima išskirti dvi stadijas: imunizacijos ir atsparumo. Imunizacijos stadijoje bakterija į savo genomo CRISPR skirtukų(S)–kartotinių(R) sritį įstato trumpą svetimos DNR sekos fragmentą S1 (naujas skirtukas) ir taip įsimena
2 pav. CRISPR sistemų veikloje galima išskirti dvi stadijas: imunizacijos ir atsparumo. Imunizacijos stadijoje bakterija į savo genomo CRISPR skirtukų(S)–kartotinių(R) sritį įstato trumpą svetimos DNR sekos fragmentą S1 (naujas skirtukas) ir taip įsimena viruso užpuoliko profilį. Kadangi skirtukas įstatomas į genomą, bakterijos gali perduoti viruso profilį ir atsparumą kitoms kartoms. Atsparumo stadijoje CRISPR lokusas pradžioje nurašomas į ilgą RNR molekulę, kurią Cas baltymai sukarpo į trumpas crRNR (CRISPR RNR), turinčias po vieną unikalų skirtuką. CRISPR3 sistemoje Cas9 baltymas sujungia crRNR molekulę į ribonukleobaltyminį (RNB) kompleksą, kuriame crRNR veikia kaip vedlys, atpažįstantis viruso užpuoliko DNR profilį (proskirtuką) per vandenilinius ryšius, o Cas9 baltymas perkerpa viruso DNR ir taip sustabdo jo plitimą. Cas9 baltymas turi du atskirus RuvC- ir HNH-aktyvius centrus priešingoms DNR grandinėms kirpti. Taigi Cas9-crRNR kompleksas veikia kaip RNR programuojama endonukleazė, kur RNR komponentas dalyvauja atpažįstant taikinį, o baltyminis komponentas – kerpant DNR. Pakeitus RNR programą (crRNR) Cas9 „žirkles“ galima nukreipti į bet kurią DNR vietą. Šis atradimas sukūrė prielaidas konstruoti universalias Cas9 paremtas RNR programuojamas DNR „molekulių žirkles“, kurios dabar yra naudojamos genomams redaguoti.
© VU nuotr.

Šį įterptą viruso DNR fragmentą vėliau bakterijos panaudoja mažų RNR molekulių, vadinamų crRNR, sintezei ir sujungia šias crRNR molekules su Cas baltymais į kompleksą, kuris atsimena virusą užpuoliką padedamas crRNR molekulės ir jį nužudo, jei jis dar kartą bando pulti bakterijas. Atrodytų, kad įgijusios tokią antivirusinės apsaugos sistemą bakterijos turėtų ilgai ir laimingai gyventi ir virusai neturėtų daugiau kelti joms grėsmės. Tačiau virusui susidūrimas su bakterija yra tas pats „būti ar nebūti“ klausimas: jei virusas nepateks į bakteriją, jis negalės pasidauginti. Čia ir prasideda tikros ginklavimosi varžybos: virusai keičia savo genomą, kad išvengtų antivirusinės apsaugos sistemų, o bakterijos priverstos ieškoti naujų apsaugos mechanizmų.

VU Biotechnologijos instituto Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimo skyriuje mes jau daugelį metų tiriame bakterijų antivirusinės apsaugos sistemų mechanizmus. Norime suprasti, kaip tos antivirusinės apsaugos sistemos veikia, t. y. kaip bakterijos atskiria savo DNR nuo svetimos, kodėl sunaikina svetimą DNR, bet neliečia savos. Daugelį metų mūsų dėmesys buvo nukreiptas į bakterijų restrikcijos-modifikacijos sistemas, kurios taip pat padeda bakterijoms apsisaugoti nuo virusų. Restrikcijos-modifikacijos sistemas jau buvome perpratę, o kaip molekuliniu lygmeniu veikia CRISPR sistemos, nebuvo žinoma.

Tyrimo objektu pasirinkome Streptococcus thermophilus bakterijų kamieną, turintį keturias skirtingas CRISPR sistemas, kurios skiriasi savo CRISPR regiono sandara ir Cas baltymais. Laboratorijoje nemokėjome rauginti jogurto ar auginti S. thermophilus bakterijų, todėl nusprendėme S. thermophilus CRISPR sistemą perkelti į žarnyno bakterijų E. coli kamieną, kuris yra biochemikų „darbinis arklys“. Bandymams pasirinkome CRISPR sistemą, kurią sudaro tik keturi Cas baltymus koduojantys genai. Mūsų nuostabai, jogurto bakterijų CRISPR apsaugos sistema, perkelta į E. coli, apsaugojo nuo virusų ir E. coli ląsteles. Paaiškėjo, kad tą apsaugą suteikia vienintelis baltymas, vadinamas Cas9, prie kurio prisijungia dvi mažos RNR molekulės (2 pav.).

Mes nustatėme, kad viena iš tų RNR molekulių, vadinamų crRNR, veikia kaip vedlys, kuris suranda taikinį DNR molekulėje, o tada Cas9 baltymas perkerpa abi DNR molekulės vijas tam tikroje vietoje. Taip Cas9 baltymas, vedamas crRNR, atpažįsta viruso DNR ir ją sunaikina. Pakeitus crRNR molekulę, Cas9 baltymą galima perprogramuoti ir nukreipti į kitą DNR molekulės vietą. Taigi Cas9 veikia kaip crRNR programuojamos DNR molekulių žirklės. Išsiaiškinę mechanizmą, kaip Cas9 atpažįsta ir sunaikina viruso DNR, mes supratome, kad Cas9 gali būti panaudotas kaip universalios molekulių žirklės genomui redaguoti.

Gyvuosius organizmus valdanti programa yra užrašyta DNR molekulėje keturiomis raidėmis – A, C, T, G. Jei ta programa sutrinka, pavyzdžiui, pasikeičia raidės arba dalis jų iškrinta, arba jos pradeda reguliariai kartotis, ląstelės likimas dažnai pasikeičia. DNR sekos raidžių pasikeitimai (mutacijos) lemia, pavyzdžiui, paveldimas genetines ligas. Šiuolaikiniai DNR sekoskaitos metodai leido iššifruoti įvairių organizmų DNR programų kodus ir surasti galimas klaidas, bet trūko molekulinių įrankių, kurie galėtų tas klaidas ištaisyti. Čia į pagalbą ir atėjo Cas9 baltymas: keičiant jo crRNR, jį galima nukreipti į bet kurią genomo vietą, pvz., šalia DNR klaidos, ir perkirpti DNR grandinę. Užlopydama DNR trūkį homologinės rekombinacijos metu, ląstelė ištaiso DNR klaidą. Šitaip, panaudojant Cas9, galima ne tik ištaisyti DNR klaidas, bet ir vienus genus išjungti, o kitus – įjungti ir kartu perrašyti DNR programą, valdančią gyvuosius organizmus.

Cas9 baltymas tapo galingu įrankiu, kuris leido mokslininkams redaguoti arba pertvarkyti organizmų genomus ir sukėlė revoliuciją šioje srityje. Ši istorija, kuri prasidėjo siekiant suprasti, kaip jogurto bakterijos ginasi nuo savo amžinų priešų virusų, o baigėsi naujo genomų redagavimo įrankio sukūrimu, puikiai parodo, kaip fundamentinių gyvybės mechanizmų tyrimas atveria kelius naujoms technologijoms.

2015 m. birželio 23 d. Jungtinių Amerikos Valstijų kompanija „DuPont Pioneer“ („DuPont“), pasaulinė lyderė pažangių augalų genetikos plėtojimo ir tiekimo srityje, paskelbė apie technologijos licencijavimą ir bendrų tyrimų sutartį su Vilniaus universitetu, kuria siekiama technologiniu ir komerciniu aspektu paskatinti kryptingai valdomu Cas9 įrankiu paremtą genomo redagavimo technologiją. Pagal sutartį „DuPont“ įgijo išskirtinę Vilniaus universiteto intelektinės nuosavybės licenciją, apimančią visą galimą komercinį panaudojimą, įskaitant žemės ūkio sritį. Be to, Vilniaus universitetas ir „DuPont“ pasirašė kelerių metų bendrų tyrimų sutartį dėl tolesnio technologijos plėtojimo.

„Spectrum“
Parašykite savo nuomonę
arba diskutuokite anonimiškai čia
Skelbdami savo nuomonę, Jūs sutinkate su taisyklėmis
Rodyti diskusiją Rodyti diskusiją
 
Naujienų prenumerata

Mokslas

Prieš daugiau nei šimtmetį rastos mumifikuotos kojos yra vienos žymiausių Egipto karalienių (11)

Archeologų teigimu, tyrimas parodė, kad daugiau nei prieš šimtmetį Egipto Karalių Slėnyje esančiame kape rastos mumifikuotos kojos yra karalienės Nefertarės (Nefertari) - pagrindinės ir mylimiausios Egipto faraono Ramzio II žmonos.

„Cassini“ zondas pradėjo artimesnę pažintį su Saturnu (11)

Ši dujinė milžinė taps „Cassini“ kapu – nes kitų metų rugsėjį jis įskris į šios planetos atmosferą, kurioje jis bus sunaikintas. Tačiau prieš tai zondas spės mums į Žemę atsiųsti dar niekada iš taip arti nematyto Saturno nuotraukas.

Natūralius organus keis dirbtiniai (22)

Vis daugiau žmonių pasaulyje gyvena su svetimais inkstais, ragenomis, širdimis, plaučiais, kepenimis ar kitais transplantuotais organais bei audiniais. Žmonių, kuriems reikia persodinti vieną ar kitą organą, skaičius nemažėja ir nepakanka donorų, galinčių paaukoti organus ligoniui. Šiandien, plėtojantis naujoms technologijoms, mokslininkai vis drąsiau kalba apie dirbtinių biologinių audinių ar net organų kūrimą.

Neišsimiegojęs ar girtas už vairo – vienodai pavojingi (7)

Jei nenori padaryti avarijos, geriau išsimiegok bent septynias valandas. JAV mokslininkai atliko tyrimą, kuris parodė, kad miego trūkumas žmogui sukuria girtumui prilygstančią būseną, rašo „The Telegraph“.

Mirtinas šaltis ar mirtį nugalintis šaltis – Lozoriau, kelkis! (6)

Neseniai nuo vėžio miręs paauglys tapo dar vienu žmogumi, kurio kūnas po mirties buvo kriogeniškai užšaldytas. Šiai procedūrai pasiryžę žmonės tikėjosi, kad ateityje bus sukurti būdai, kaip juos atšildyti bei išgydyti juos nužudžiusią ligą.